自1990年雙光子顯微鏡（Two-photon microscopy, 2PM）被報(bào)道以來，基于飛秒激光的非線性效應(yīng)，雙光子顯微鏡相較于常規(guī)連續(xù)光激發(fā)的顯微鏡（如共聚焦顯微鏡），具有兩個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：①雙光子激發(fā)波長更長，一定程度上可減少對樣品的光漂白和光損傷；②基于非線性效應(yīng)帶來了光學(xué)切片能力，使成像系統(tǒng)中無須共聚焦小孔。

相較于可見光波段，近紅外光在生物組織內(nèi)的穿透性更高，衰減程度更小，使成像深度變得更深，使得大多數(shù)以近紅外波長激發(fā)的雙光子顯微鏡迅速成為腦科學(xué)結(jié)構(gòu)及功能研究的重要工具。類比于其他光學(xué)成像技術(shù)，如光學(xué)相干斷層成像（OCT）和光聲成像（PAM/PACT）等，其他技術(shù)雖在成像深度上同樣具備優(yōu)勢，但在分辨率上通常難以達(dá)到雙光子顯微鏡亞微米級的細(xì)胞成像分辨率水平。

進(jìn)一步地，康奈爾大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2013年發(fā)現(xiàn)三光子顯微鏡（Three-photon microscppy, 3PM）相比于雙光子能更大程度地利用飛秒激光，以更高的非線性系數(shù)進(jìn)行更深層樣本的激發(fā)與成像。自此，三光子顯微成像技術(shù)逐漸走進(jìn)大家的視野，彰顯“威力"。

圖1 小鼠腦內(nèi)不同成像深度處的雙光子與三光子顯微成像質(zhì)量對比

如圖1所示，在雙光子及三光子顯微成像的示例中，隨著深度的增加（＞ 550 μm），組織深處的三光子成像分辨率顯著由于雙光子顯微鏡。結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)可以進(jìn)一步獲得令人振奮的結(jié)果——三光子顯微成像甚至可以直接透過小鼠顱骨進(jìn)行神經(jīng)元及血管成像，如圖2所示。

圖2 使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)透過完整顱骨對小鼠神經(jīng)元和血管系統(tǒng)進(jìn)行三光子成像

，成像深度受限于生物組織內(nèi)光子的散射和吸收。就激發(fā)光而言，隨著成像位置越深，到達(dá)焦面處的光子就越少?？此瓶赏ㄟ^增加激光功率來補(bǔ)償光子的損失，然而生物樣品表面光功率過強(qiáng)則可能會造成樣品損傷的風(fēng)險(xiǎn)。即使控制激發(fā)光束功率低于組織損傷閾值，但隨著焦面變深，激發(fā)光束也會在樣品表面至焦面的“錐體"內(nèi)產(chǎn)生不同程度的背景噪聲。當(dāng)?shù)竭_(dá)某一深度時(shí)，背噪強(qiáng)度會徹湮沒信號，最終限制成像深度。在雙光子成像中，目標(biāo)成像深度一旦超出成像信背比（SBR）極時(shí)，縱使增加激發(fā)光功率，也難以提升圖像質(zhì)量。而三光子成像因?yàn)榫邆涓叩姆蔷€性條件，可有效降低背景，獲得了比雙光子成像更深的范圍。

三光子顯微成像看似具有如此顯著的優(yōu)勢，但是實(shí)際應(yīng)用過程中似乎仍面臨不少技術(shù)問題。美國Allen腦研究所的學(xué)者表示：“三光子成像技術(shù)的現(xiàn)狀，類似于早期雙光子誕生時(shí)類似的情況——即在成像新技術(shù)剛問世的數(shù)年內(nèi)，人們在實(shí)際成像時(shí)仍需要花費(fèi)大量精力來獲取高質(zhì)量、有意義的圖像。"那么，相比于較為成熟的雙光子成像技術(shù)，目前三光子成像技術(shù)發(fā)展還存在哪些難點(diǎn)，又該如何克服？

激發(fā)波長的選擇

圖3 800~2800 nm的組織衰減（散射+吸收）示意曲線，主要說明1300 nm和1700 nm處的生物成像窗口

與雙光子過程相比，三光子激發(fā)需要具備更長的入射波長。例如，常用的神經(jīng)示蹤劑GCaMPs綠色熒光蛋白，其雙光子激發(fā)波段為920~940 nm，但在三光子激發(fā)時(shí)波長則需要拓展至~1300 nm。又比如，紅移探針需要~1100 nm雙光子激發(fā)波長，而三光子中則需要在~1700 nm處激發(fā)。4,5因此可見，波長可調(diào)諧的激光器，相比于單一波長的激光器，能滿足不同的熒光分子的激發(fā)波長調(diào)諧需求，在雙光子、三光子成像研究中占據(jù)主流。實(shí)際應(yīng)用中，就波長而言，針對各類穩(wěn)定調(diào)諧激光器、成像窗口、成像探針等問題，仍有較大發(fā)掘空間。

雙光子成像所使用的飛秒激光器產(chǎn)生的脈寬大多為100~150 fs。而三光子過程所依賴的更高非線性，在很大程度上取決于脈沖的峰值功率，所以三光子成像則需要更短的脈寬（~50 fs）。但是在大多數(shù)情況下，如何產(chǎn)生穩(wěn)定且更短的（~50 fs）飛秒脈沖光仍是三光子技術(shù)的挑戰(zhàn)之一。此外，因?yàn)槌堂}沖光束在材料中傳播時(shí)，會出現(xiàn)群延遲色散（Group delay dispersion, GDD），導(dǎo)致不同的光譜成分在時(shí)間上被拉伸開來，在時(shí)域上體現(xiàn)為脈寬變寬，使脈沖峰值功率降低，進(jìn)而造成多光子信號強(qiáng)度降低、圖像信噪比降低。

為了解決上述色散問題，在焦面處產(chǎn)生最佳的非線性信號，人們往往在光學(xué)系統(tǒng)中加入脈沖壓縮元件，對群延遲色散進(jìn)行預(yù)補(bǔ)償（預(yù)啁啾）。但是，脈寬越短意味著光譜帶寬越大，這使得脈寬壓縮元件的設(shè)計(jì)與制造工作具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)性。因此在多光子成像技術(shù)發(fā)展歷程中，不少杰出的成像研究者們都曾聚焦于解決飛秒脈沖管理，構(gòu)建合適的脈寬壓縮組件，使得脈沖在焦平面上的脈寬最短。

脈寬壓縮程度至關(guān)重要。當(dāng)脈寬壓縮充足時(shí)，保障了三光子信號采集的必要條件；倘若壓縮不充分、脈寬過大，則縱使將功率調(diào)高到燒壞樣品的水平，也根本無法探測到三光子信號。由此見得，針對三光子成像，激光器本身的研究其實(shí)仍然大有可為、充滿挑戰(zhàn)。

從實(shí)現(xiàn)雙光子到實(shí)現(xiàn)三光子，由于兩者的激發(fā)截面的差異，三光子的實(shí)現(xiàn)不僅需要將脈沖縮短到~50 fs左右，還需要大幅增加單脈沖能量。但是市售顯微物鏡及其他光學(xué)元件，幾乎較少針對三光子激發(fā)波長進(jìn)行高透射、低色散設(shè)計(jì)及優(yōu)化，很可能使得全系統(tǒng)的透過率僅為10%左右。因此，應(yīng)當(dāng)充分考慮如何權(quán)衡好峰值功率（脈沖能量）、重復(fù)頻率、平均功率這三個(gè)主要參數(shù)之間的關(guān)系。

大多數(shù)情況下，飛秒激光~100 mW左右的平均功率，可在點(diǎn)掃描時(shí)確保生物樣品無損傷。而針對上述估算的10%光學(xué)系統(tǒng)透過率而言，所采用的三光子成像飛秒激光器則應(yīng)產(chǎn)生至少~1 W的平均功率。隨之會帶來有趣的問題：1W的平均功率，究竟是以“1 MHz，1 μJ"形式輸出，還是通過“10 MHz，100 nJ"輸出？目前，大多數(shù)三光子成像都是在1 MHz重頻下進(jìn)行，像素駐留時(shí)間為數(shù)微秒，每個(gè)像素累積單個(gè)或多個(gè)脈沖產(chǎn)生的信號，所以可以在每秒數(shù)幀的成像的幀率下產(chǎn)生足夠的信號量。若通過提高重頻以匹配共振鏡諧振頻率，確實(shí)可以進(jìn)一步加速成像幀率，但隨之帶來的是平均功率的增加，可能會增大樣品損傷風(fēng)險(xiǎn)。

一味地把單脈沖能量拉高時(shí)，理想情況下會產(chǎn)生越來越明亮的多光子信號，但實(shí)際情況是：能量過高會導(dǎo)致組織非線性損傷。同理，雖然增大平均功率、重復(fù)頻率，可以增強(qiáng)信號并實(shí)現(xiàn)高速成像，但功率過大也會導(dǎo)致熱效應(yīng)過高。這些因素使得激光器波長范圍內(nèi)的三光子成像窗口并不寬裕，而且成像窗口會隨樣品和成像深度產(chǎn)生變化，使三光子成像激光器的參數(shù)選擇變得復(fù)雜。已有研究討論了最佳重復(fù)頻率與組織散射、成像深度的函數(shù)關(guān)系，如圖4所示。從圖中綠色區(qū)域可以看出，入射光最佳參數(shù)范圍隨著深度的增加而明顯變化。例如，在600 μm深度處，重頻越高越好；而在1 mm深度處，則存在1 MHz的優(yōu)重頻。

圖4 在有效衰減長度分別為600 μm和1 mm的散射組織中，實(shí)現(xiàn)三光子成像的最佳單脈沖能量和重頻

相比于傳統(tǒng)雙光子成像飛秒激光器80 MHz的高重頻，三光子成像時(shí)，需要激光器具有較低重復(fù)率、較高的單脈沖能量，因此往往利用1030 nm高能量激光來泵浦可調(diào)諧光學(xué)參量放大器（OPA），從而調(diào)諧至相對合適的激發(fā)波長。大多數(shù)OPA的波長、重頻、功率雖然可調(diào)，但通常只能以恒定不變的泵浦能量運(yùn)轉(zhuǎn)，因此成像時(shí)一般需確保組織深處足夠的能量裕量，而對較淺平面成像時(shí)則需進(jìn)行溫和地能量控制。

由此可見，激光器能量、功率、光束模式以及長期穩(wěn)定性，也屬于三光子成像技術(shù)的考量范疇。特別是在用于快速三光子成像時(shí)，由于單像素駐留時(shí)間短，激光噪聲抖動對于圖像質(zhì)量影響突出。而在數(shù)智光學(xué)時(shí)代，在增強(qiáng)多光子成像深度和對比度方面，迅猛發(fā)展的自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)也充滿著巨大潛力及研究價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：今日材料論文